O processo de produção de eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) inclui principalmente etapas como preparação do gel, operação de eletroforese, coloração e observação de resultados.
Preparação do gel Preparação do gel de separação (10%): Misture 0 ml de ddH₂O, 3 mL de gel estoque a 30%, 5 mL de Tris-HCl 5 mol/L, 1 mL de SDS a 10% e 1 mL de AP a 10%, adicione 10 μL de TEMED para selar o fundo e, em seguida, adicione 4 μL de TEMED e misture bem. Despeje esta mistura entre as placas de vidro, sele a superfície com água e aguarde 30 a 60 minutos para que o gel polimerize completamente.
Preparação do gel de empilhamento (4%): Misture 4 ml de ddH₂O, 33 ml de gel estoque a 30%, 25 mL de Tris-HCl 1 mol/L, 0,2 ml de SDS a 10% e 0,2 ml de AP a 10%, adicione 2 μL de TEMED e misture bem imediatamente. Despeje a água sobre o gel de separação, adicione esta mistura e insira imediatamente o pente entre as placas de vidro, aguardando de 15 a 30 minutos para que o gel de empilhamento polimerize completamente.
Operação de eletroforese Tratamento de amostra: Misture a amostra com uma quantidade igual de tampão de carga 2XSDS, aqueça a 100 graus por 3-5 minutos e, em seguida, centrifugue a 12.000 rpm por 1 minuto e leve o sobrenadante para análise SDS-PAGE.
Carregamento: Pegue 10 μL de amostras induzidas e não induzidas e adicione-as ao conjunto de amostras, e adicione 20 μL de padrões de proteína de baixo peso molecular como controle.
Eletroforese: Adicione 1X tampão de eletroforese ao tanque de eletroforese, conecte a fonte de alimentação, mantenha a tensão do gel de empilhamento em 60V e a tensão do gel de separação em 100V. Quando o azul de bromofenol atingir o fundo do tanque de eletroforese, interrompa a eletroforese (cerca de 3 horas).
Coloração e observação de resultados
Coloração: Remover o gel da placa de vidro e corá-lo com solução corante Coomassie Brilliant Blue por 4 a 6 horas em temperatura ambiente. Descoloração: Coloque o gel corado na solução descolorante e descolora-o várias vezes até que a banda proteica fique claramente visível. Observação dos resultados: Após a descoloração, o gel pode ser fotografado e guardado. Após a conclusão da etapa de descoloração, coloque o gel no sistema de processamento de imagem para fotografia e salve os resultados em um disquete.